ПЦР (Полимеразная цепная реакция) — это метод определения фрагментов генетического материала (ДНК или РНК) в биологической среде. Это один из наиболее точных и быстрых методов диагностики инфекционных заболеваний, в том числе инфекций, передающиеся половым путём (ИППП).
ПЦР была открыта в 1986 году американским биохимиком Кэри Маллисом. За это открытие ученый был удостоен Нобелевской премии по химии в 1993 году. Свое применение метод нашел в множестве сфер биологической и медицинской практики.
Что такое ДНК и РНК?
ДНК — это макромолекула, которая в живом организме обеспечивает хранение и передачу из поколения в поколение генетической информации.
РНК — макромолекула, которая обеспечивает кодирование, прочтение и проявление генов.
Генетическая информация микроорганизмов может быть представлена или в виде ДНК, или РНК.
ДНК и РНК представляют ряд нуклеотидов, каждый из которых содержит фосфатную группу, сахар (разный для РНК и ДНК) и одно из четырех азотистых оснований (аденин, гуанин, цитозин и тимин/урацил). РНК всегда одноцепочечна, а ДНК всегда существует в виде двойной спирали, где азотистые основания двух цепей соединяются между собой водородными связями, соединяющими всегда аденин с тимином, а гуанин — только с цитозином. Это называется комплементарностью.
Суть метода
Метод основывается на многократном увеличении числа копий специфического участка ДНК (направленная амплификация ДНК) или РНК — генетического материала инфекционного агента. Именно за счет многократного копирования уровень специфической нуклеотидной последовательности в пробе вырастает в 106-108 раз, что и обеспечивает высокий уровень чувствительности метода. Для амплификации нужен фермент ДНК-полимераза, полученный с термофильных бактерий и обладающий стойкостью к нагреванию, праймеры (молекулы, которые служат начальным пунктом для удвоения нуклеиновых кислот), нуклеотиды (структурные единицы ДНК), буферный раствор и прибор, обеспечивающий нужную температуру для реакции.
Сначала двухцепочную ДНК нагревают до 94-96°С, что приводит к разделению цепей (денатурации). Дальше температуру снижают и праймеры начинают связываться с расщепленными цепями ДНК. И после этого ДНК-полимераза начинает удвоение нуклеотидов, используя праймер.
Вирусы могут иметь генетический материал, представленный не ДНК, а РНК. В таких случаях для диагностики используют ПЦР с обратной транскрипцией. Метод отличается тем, что перед стандартными реакциями молекулу РНК с помощью обратной транскриптазы превращают в комплементарную цепь ДНК.
Этапы диагностики
Диагностика методом ПЦР проводится в несколько этапов:
- Забор материала
- Транспортировка и хранение материала
- Выделение ДНК из материала.
- Амплификация ДНК: проводится с помощью амплификационных смесей в термостате
- Интерпретация результатов с помощью электрофореза в присутствии бромистого этидия: при просмотре в ультрафиолетовом свете наличие светящихся участков свидетельствует о положительном результате
Также возможно проведение количественной ПЦР. Проанализировав данные этой реакции, врач может оценить степень активности процесса и назначить нужное лечение.
Преимущества метода
- Высокая чувствительность — тест-системы позволяют обнаружить патогенные для человека бактерии и вирусы даже тогда, когда другими методами (серологическими, бактериологическими, микроскопическими) их выявление невозможно.
- Высокая специфичность — в изучаемом материале выявляется уникальная, характерная только для данного вида возбудителя часть ДНК. Таким образом удается избежать проблем с перекрестно-реагирующими антигенами.
- Быстрота получения результатов.
- Универсальность. Для ПЦР может использоваться разный материал (кровь, моча, мазок, смыв, соскоб и т.д.).
Недостатки метода
- Небольшая вероятность ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Ложноположительный результат может появиться вследствие слишком высокой чувствительности метода. Самые незначимые клинически количества генетического материала вследствие многократного увеличения могут представиться положительным. Такой же ложный результат может появиться вследствие загрязненности праймеров. А ложноотрицательный возникает вследствие наличия в биологическом материале или питательной среде различных ингибиторов ПЦР ( например, гемоглобин).
- Высокая стоимость